LLOUBES LAB | Transports macromoléculaires à travers l'enveloppe bactérienne

Notre équipe s’intéresse à l’assemblage et au fonctionnement de deux moteurs moléculaires membranaires présents chez les bactéries à Gram-négatif : les macrocomplexes protéiques Tol et Ton.
Ces deux systèmes utilisent l’énergie issue de la force proton motrice afin d’assurer des fonctions essentielles à la survie des bactéries. Le système Ton permet le transport actif haute affinité de métaux, de cyanocobalamine et de sucres à travers les récepteurs TonB dépendants de membrane externe. La fonction du système Tol est plus complexe. Il est impliqué dans le maintien de l’intégrité de la membrane externe, dans la localisation de facteur polaire et de chémorécepteurs, dans l’homéostasie des phospholipides de la membrane externe ainsi que dans l’étape de constriction de la membrane externe lors de la division cellulaire. Les systèmes Tol et Ton peuvent être parasités par des bactériotoxines (macromolécules à activité létale, nommées aussi colicines) pour permettre leur import à travers l’enveloppe bactérienne. Ils peuvent également être détournés pour permettre à certains phages filamenteux d’injecter leur ADN dans leur hôte bactérien afin de se multiplier. C’est par exemple le cas du phage M13 infectant E. coli et du phage CTX, spécifique de V. cholerae.
Les systèmes Tol et Ton présentent des homologies structurales, avec la présence d’un sous complexe de membrane interne composé des protéines TolQ-TolR-TolA et ExbB-ExbD-TonB, respectivement. Au sein de ces sous-complexes, les protéines TolA et TonB présentent une structure étendue qui traverse le périplasme et interagit avec les protéines associées à la membrane externe. Il s’agit du sous complexe composé de TolB et de la lipoprotéine Pal pour TolA, et des récepteurs de membrane externe TonB dépendants (TBDT) pour la protéine TonB.

Les complexes formés des protéines TonB-ExbB-ExbD et TolA-TolQ-TolR sont schématisées avec les structures résolues de domaines solubles.
Les récepteurs TonB dépendants (TBDT) de membrane externe ainsi que le complexe TolB-Pal sont décrits.
PMF (proton motive force) et interactions protéine-protéine entre sous-complexes sont représentés par des flèches.

Ces nano-machines forment des moteurs moléculaires qui transforment le potentiel électrochimique en énergie mécanique via un mécanisme de transduction d'énergie longue distance, de la membrane interne jusqu'à des protéines liées à la membrane externe. Bien que les structures de plusieurs domaines solubles isolés aient été résolues pour chacun des complexes depuis plus de dix années, ce n’est qu’en fin 2016 que nous avons avec nos collaborateurs résolu la structure du complexe membranaire formé par les protéines ExbB et ExbD.
Nos travaux actuels se divisent en trois grands axes :

I - Analyses structurales et fonctionnelles des complexes Tol et Ton

Les complexes Tol et Ton utilisent le potentiel électrochimique de la membrane interne afin d’assurer des fonctions essentielles à la survie des bactéries. Ces nano-machines composés des sous unités TolQ, TolR et TolA, et ExbB, ExbD et TonB, forment des moteurs moléculaires où la sous-unité TolA interagit avec le complexe TolB-Pal et la sous-unité TonB avec les récepteurs TonB dépendants de la membrane externe. Il a été démontré que les sous-complexes TolQ-TolR et ExbB-ExbD sont échangeables pour assurer l’entrée des colicines et que TolQ-TolR complémente partiellement la fonction de transport actif naturellement médiée par le couple ExbB-ExbD.
Afin d’obtenir une vision intégrée des complexe Tol et Ton de membrane interne, nous avons débuté une étude pluridisciplinaire alliant des techniques de génétique, de biochimie et de biophysique en collaboration avec d’autres laboratoires. L’assemblage et la fonctionnalité de ces complexes sont analysés in vivo via des techniques de pontage chimique et le suivi de la division cellulaire ou de l’intégrité membranaire pour les complexes Tol et de l’import du Fer pour le système Ton. La fonctionnalité de ces systèmes est aussi étudiée en suivant l’activité des colicines et l’infection par les phages filamenteux.
Nous avons débuté la caractérisation de ces complexes en suivant cinq grands axes:

  1. L’étude des interactions in vivo entre les sous unités.
  2. L’étude fonctionnelle des complexes purifiés après reconstitution dans des bicouches lipidiques planes.
  3. L’analyse structurale des domaines solubles par RMN.
  4. L’étude structurale et dynamique des complexes par RPE.
  5. La structure haute résolution de ces complexes membranaires.

Récemment, nous avons pu caractériser les canaux ioniques formés par l’oligomère ExbB ou par le complexe ExbB/ExbD et avons obtenu des données structurales à haute résolution du complexe ExbB-ExbD en collaboration avec des équipes internationales.

Structure du complexe ExbB-ExbD* (ExbD* correspond à ExbD délétée du domaine périplasmique).
La représentation électrostatique de surface (panneaux de gauche) et du canal vu en coupe (panneau du centre)
montre en bleu les charges électropositives qui forment des ceintures (coté cytoplasmique et coté canal)
et en rouge les charges électronégatives qui forment une coiffe (coté cytoplasmique et extrémité du canal) du pentamère d’ExbB.
L’hélice hydrophobe d’ExbD (colorée en bleu, panneau de droite) a été résolue dans le canal transmembranaire formé par le pentamère ExbB (gris).

II - Etude de la dynamique des protéines du système Tol-Pal

En collaboration avec une équipe de l’Institut de Microbiologie de la Méditerranée, nous avons développé une approche d’imagerie in vivo utilisant la microscopie de fluorescence. Les techniques de microscopie haute résolution (HR) en microfluidique sont utilisées afin de pouvoir étudier la dynamique des protéines Tol-Pal lors de la division cellulaire et en réponse à diverses conditions de croissance ou en suivant l’effet de mutations ciblées.

III - Implications moléculaires du système Tol-Pal dans l’adaptation et la conversion pathogénique de Vibrio cholerae.

Si les systèmes Tol et Ton ont intenssivement été étudiés, notamment chez E. coli , de nombreuses questions demeurent quant à l’assemblage, au fonctionnement et au rôle biologique de ces complexes.
Nous avons choisi de développer le modèle Vibrio cholerae au laboratoire afin d’ouvrir une nouvelle perspective dans la compréhension des complexes membranaires. En effet, le système Tol est conservé chez les Vibrionacées, mais présente des spécificités en terme de séquences et de phénotypes dont il est possible de tirer parti pour disséquer les relations structures-fonctions de ce complexe protéique.

Notre modèle d’étude :
Vibrio cholerae est une bactérie Gram négatif halophile commune des environnements aquatiques saumâtres. C’est aussi l’agent responsable de la maladie du cholera. Le caractère explosif des épidémies repose sur la présence de nombreux facteurs de virulence, le principal étant la toxine cholérique CT. De manière intéressante, la toxine cholerique n’est pas codée par le génome core de la bactérie, mais par le génome du bactériophage filamenteux CTX-phi, un virus spécifique de V. cholerae. Ainsi, l’un des facteurs de virulence essentiel à la pathogénicité est disséminé d’une souche de Vibrio à une autre par transduction naturelle dans l’environnement.
Tout comme pour les phages filamenteux M13 ou Fd parasitant E. coli , il a été montré que le bactériophage CTX-phi parasite le système Tol-Pal afin de pénétrer l’espace périplasmique selon un schéma encore mal connu. Une des étapes de l’infection requiert l’interaction entre la protéine pIII localisée à l’extrémité du phage, et la protéine TolA dans l’espace périplasmique.

Les objectifs de cet axe de recherche sont :

  • Disséquer l’interaction entre CTX et les composants du moteur Tol-Pal afin de comprendre comment la spécificité phage-hôte est assurée.
  • Aborder la reconnaissance phage-bactérie sur le plan dynamique et accéder à la séquence des étapes mises en jeu lors de l’infection.
  • Etudier les mécanismes de régulation génique du cluster Tol-Pal en réponse aux signaux de l’environnement.
A plus long terme, les données fondamentales obtenues serviront à la compréhension de la conversion pathogénique des couples bactérie/phage, ainsi qu’à l’ingénierie de phages hybrides capables de délivrer des molécules d’intérêt dans une bactérie cible.